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摘要
本文探討利用真核生物逆轉錄因子蛋白實現人類安全位點的基因插入，揭示了這一新技術對未來醫療的重要影響。 歸納要點:
- PRINT技術相比CRISPR/Cas9系統,具備更高的特異性與準確度,有效降低脫靶效應。
- ZoAl R2蛋白是PRINT系統的核心,能精準將外源基因片段插入目標位點,具有廣泛的應用潛力。
- 鳥類R2蛋白提供了新的研究方向,其獨特的RNA模板效應提升了基因編輯的效率與安全性。
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我們在研究許多文章後,彙整重點如下
網路文章觀點與我們總結
- PRINT技術利用逆轉錄酶R2進行RNA介導的基因插入,為基因治療提供新希望。
- CRISPR技術能快速精準地在各種生物中進行基因的插入、編輯或刪除。
- 大片段DNA插入是將較大的DNA序列準確地放置到特定基因組位置的方法。
- Retron與CRISPR結合使用,可提升基因編輯性能與效率,適用於多種情況。
- 2023年底,美國和英國批准首項CRISPR基因編輯療法Casgevy,用於治療鐮刀型貧血病。
- 這些技術使得基因編輯變得更加簡單且不會影響其他部分的基因組。
隨著科技的不斷進步，像PRINT和CRISPR這樣的基因編輯技術正為我們帶來新的希望。不僅可以精確改變生物體中的特定基因，還有助於開發新的治療方法，例如解決某些遺傳疾病。這不僅是一場科學革命，也可能改變未來醫療的面貌，我們期待在健康和農業領域看到更多突破！
PRINT 技術：精準基因編輯的新突破
這項研究介紹了一種名為 PRINT（精確 RNA 介導的外源基因插入）的新方法，用於將基因插入人類基因組中的特定位置。該技術利用來自 R2 逆轉錄元素的蛋白質，R2 是在許多動物中發現的可移動遺傳元素，將 RNA 範本的 DNA 副本插入到核糖體 DNA 基因中的特定位置。**PRINT 的主要元件與機制：**
1． 將兩種 RNA 元件送入細胞：
－ 編碼 R2 蛋白質的 mRNA
－ 包含要插入外源基因的範本 RNA
2． R2 蛋白識別核糖體 DNA 基因中特定的 DNA 序列，在一條鏈上建立缺口，並利用該缺口直接促進範本 RNA 在基因組中的反向轉錄。
3． 它以多複製核糖體 DNA 基因作為“安全港”位置，能夠容忍插入而不破壞重要基因。
**專案1：PRINT 技術的突破性優勢與未來發展方向**
PRINT 技術突破了傳統基因編輯方法的侷限，為基因治療提供了新的希望。其精準插入的特性，可避免傳統方法隨機插入帶來的潛在風險，並利用核醣體 DNA 序列作為安全港，進一步提高安全性。PRINT 技術可直接利用 RNA 進行基因編輯，簡化了操作流程，使其在基因治療應用上更具吸引力。未來發展方向主要集中在以下幾個方面：
* **拓展靶向基因範圍：**目前 PRINT 技術主要針對核醣體 DNA 序列，未來研究將擴充套件至其他基因位點，以滿足更廣泛的基因治療需求。
* **提高效率和特異性：**進一步最佳化 R2 蛋白及範本 RNA 的設計，提高 PRINT 技術的效率和特異性，降低脫靶風險。
* **開發新型載體：**探索更有效的載體系統，以提高 PRINT 技術的遞送效率，並克服細胞膜屏障，實現更廣泛細胞型別靶向。
**專案2：PRINT 技術與其他基因編輯技術的比較分析**
PRINT 技術與 CRISPR－Cas9 等主流編輯技術相比，其最大優勢在於能夠實現精準且相對安全地將外源DNA整合進目標位置，而不像傳統方法那樣可能導致非特異性的隨機整合。這種針對性的編輯方式不僅降低了潛在副作用，也提升了治療效果，因此被視為未來生物醫學領域的重要發展趨勢。
這種方法不依賴於 DNA 雙鏈斷裂或 DNA 供體模板，與其他某些基因插入方法相比，有可能減少脫靶效應和免疫反應。
ZoAl R2蛋白介導的基因編輯：高效率、高準確性與安全性
在最佳化條件下，轉基因插入的成功率超過50％，其中超過50％的插入為完整的2 kb轉基因複製。絕大多數的插入 （＞99％） 發生在預定的核糖體DNA目標位點。特別是來自白喉雀的ZoAl R2蛋白，其脫靶插入的情況相當罕見。當插入複製數量受到限制（使用具有減少內切酶活性的“ENT”版本R2蛋白），轉基因表達在長達兩個月的細胞培養中保持穩定。這一系統可應用於多種人類和動物細胞型別，並能夠插入至少4 kb長度的轉基因。使用RNA而非DNA模板可能降低隨機基因組插入的風險。而核糖體DNA目標位點被視為一個“安全港”，不太可能幹擾其他基因。這項研究結果表明，利用ZoAl R2蛋白介導的基因編輯技術，可以實現高效率、高準確性和高安全性地插入外源基因，與當前基因編輯領域發展趨勢高度一致。最新如CRISPR－Cas9及base editing等技術不斷提升其精準度及安全性，以減少脫靶效應和潛在的基因組損傷。本研究將ZoAl R2蛋白與RNA模板結合，有效降低了隨機基因組插入風險，同時透過靶向rDNA區域進一步提升了編輯安全性。因此，此研究成果將推動未來基因編輯技術發展，為治療遺傳疾病、開發新型療法以及改善農作物品種提供新的可能性。
鳥類R2蛋白的驚人發現：特異性、RNA模板效應與轉基因新突破
關鍵發現：1． 辨識出鳥類R2蛋白（特別是來自斑馬雀和白喉麻雀的蛋白），其對於自身RNA模板具有很高的特異性，這與先前研究的R2蛋白有所不同。
2． 發現這些R2蛋白需要在模板RNA的3′端有一段短小（4個核苷酸）的核糖體RNA序列，以達成有效插入，這為特異性提供了額外的一層保障。
3． 開發了一種雙RNA傳遞系統，將編碼蛋白質和模板功能分開，克服了以往在使用R2元素進行轉導時所面臨的限制。
4． 實證顯示，相較於DNA模板，使用RNA模板可以促進有效的轉基因插入，同時可能提高安全性。
5． 創造出“ENT”（內切酶調整型）版本的R2蛋白，其減少了插入頻率，但改善了轉基因表達的長期穩定性。
作者們篩選了來自不同物種的多種 R2 蛋白，以評估它們在體外執行目標引導反轉錄 （TPRT） 的能力。他們發現，來自鳥類的 R2 蛋白，特別是斑鳩 （Taeniopygia guttata， TaGu） 和白喉雀 （Zonotrichia albicollis， ZoAl），對其本土 RNA 模板具有高專一性和精確的目標位點識別能力。
研究人員發現，為了有效插入基因，模板 RNA 的 3′ 端需要有一段短的（4 個核苷酸）核糖體 RNA 序列，接著是多腺苷酸尾巴。這段序列能夠與目標位點的 DNA 進行鹼基配對，從而增強特異性和效率。透過將 R2 蛋白編碼序列和轉基因模板分開成為兩種不同的 RNA 分子，作者克服了以往在使用 R2 元素進行基因插入時所面臨的限制。這種方法允許更靈活地設計模板 RNA，同時可能減少安全性顧慮。
PRINT系統：高精準度、高效能的基因編輯技術
在最佳化條件下，PRINT系統成功實現超過50％的細胞進行基因轉殖，其中超過一半的插入片段為完整長度的2 kb基因。更重要的是，絕大多數（超過99％）的插入發生在預定的核醣體DNA靶位點，而檢測到的非目標事件則非常少見。初步實驗顯示，高複製數的插入會導致隨時間推移基因轉殖表達降低。為了解決這個問題，研究團隊創造了具有降低內切酶活性的“ENT”（內切酶調整型）R2蛋白版本。這些ENT蛋白使每個細胞中的插入數量減少至1至7個，但卻能在至少兩個月的細胞培養期間維持穩定的基因轉殖表達。**專案1：PRINT系統的精準度與效率：** PRINT系統展示出令人驚豔的基因編輯精準度與效率。研究團隊透過最佳化條件，成功在超過50％的細胞中實現基因轉殖，其中超過一半的插入片段為完整的2 kb基因。更重要的是，超過99％的插入發生在預定的核醣體DNA靶位點，非目標事件極少發生。這顯示PRINT系統不僅高效，更具備高精準度，為基因治療和細胞工程學領域帶來新的可能性。
**專案2：ENT蛋白的調控策略：** PRINT系統研究中發現，高複製數插入會導致基因轉殖表達隨時間降低。為解決此問題，研究團隊創造出具有降低內切酶活性的ENT蛋白。ENT蛋白的調控策略巧妙地控制插入複製數，使每個細胞中的插入數量維持在1－7個範圍內，同時保持至少兩個月穩定的基因轉殖表達。這種策略為解決基因編輯中常遇到之基因表達不穩定問題提供了新思維，也為建立長期穩定且可靠的基因表達系統奠定了堅實基礎。
PRINT 系統：基因編輯的全新里程碑
PRINT 系統已被證實能在多種人類及動物細胞型別中運作，包括原代細胞和轉化細胞系。研究人員還展示了長達 4 kb 的轉基因插入，包含功能性的人類端粒酶逆轉錄酶 （TERT） 基因的完整複製。對於插入接合點的詳細分析揭示了插入機制的一些重要見解：1． 轉基因的 3′ 端通常無縫接合到目標位點，由模板末端的短核糖體 RNA 序列指導。
2． 5′ 接合顯示出更多變異性，一些插入具有精確接合，有些則顯示目標位點序列的重複，而有些則表現出「反折」結構，即 cDNA 自身啟動後所形成的結構。
3． 一小部分插入包含內源性非編碼 RNA 的序列（主要是 U6 RNA），這可能是由於在逆轉錄過程中模板切換造成的。
**專案1：PRINT 系統的精準度與可控性**：結合最新趨勢，PRINT 系統展示了前所未有的精準度與可控性。傳統基因編輯技術常受限於非目標位點的插入或突變，而 PRINT 系統利用短核糖體 RNA 序列作為模板，實現了精準的 3′ 端接合，大幅降低了脫靶效應。針對 5′ 端接合的分析，揭示了 PRINT 系統不僅可以進行精準插入，還能夠利用模板自身序列進行「反折」結構的建立，為基因編輯提供了更多可能性。
**專案2：PRINT 系統的潛在應用**：結合典型查詢意圖，PRINT 系統廣泛應用潛力令人振奮。對於頂尖專家而言，PRINT 系統在基因治療、生物醫學研究和藥物開發方面擁有廣泛應用前景。例如，利用 PRINT 系統插入功能性 TERT 基因可以有效延長細胞壽命，為抗衰老研究提供新方向。PRINT 系統可以被用於構建疾病模型、研究基因功能，以及開發新的基因療法。
PRINT系統：提高基因插入安全性，開啟基因工程新紀元
PRINT系統在多個方面潛在地提高了其安全性，相較於其他一些基因插入方法：1． 使用RNA模板而非DNA，可能降低隨機基因組插入的風險，並減少先天免疫反應。傳統的基因插入技術往往依賴DNA模板，這不僅增加了非目標基因插入的可能性，還可能激發宿主的免疫系統進行攻擊。相對而言，PRINT系統利用RNA模板，使其能在細胞內直接轉錄為蛋白質，避免了DNA整合過程中潛在的不良影響，因此有效降低了非目標插入及免疫排斥的機率。
2． 針對多複製核糖體DNA提供了一個“安全港”，能夠容忍插入，而不會干擾到重要基因。這一特性大幅提升了INSERTION過程中的穩定性，使得關鍵生物學功能得以維持，同時也增強了整體操作的安全邊界。
3． R2蛋白對其目標位點具有高特異性，有效縮小了非目標插入的風險。這樣的精確定位能力是現有許多技術所無法比擬的，也使得PRINT系統成為未來研究的重要工具。
4． 該系統不依賴於雙鏈DNA斷裂，而這種斷裂常常導致意外的基因組重排。因此，在設計上更為溫和且可控，有助於確保遺傳材料的一致性與完整性。
PRINT技術的發展代表了一種創新的基本研究應用，其靈感源自逆轉錄元件，用以解決生物技術和基因治療領域中的重要挑戰。透過重新利用高度演化出的R2元素針對位點特異性的優勢，作者們創造出一套結合高效基因插入與潛在改進安全性的系統，相較於現有的方法顯示出更大的前景與希望。
PRINT系統：基因治療的未來潛力與基礎研究的重要價值
這篇論文對 PRINT 系統進行了全面的特徵描述，涵蓋了從 R2 蛋白的初步選擇與最佳化，到插入結果和長期穩定性的詳細分析。這種徹底的方法為該技術的未來發展和最佳化奠定了堅實的基礎。儘管在 PRINT 系統能夠用於治療之前仍有大量工作需要完成，包括長期體內研究和高效遞送方法的開發，但這一系統顯示出巨大的潛力。如果其在效率和安全性方面的潛在優勢在後續研究中得到證實，PRINT 可能成為基因治療工具箱中的一個重要新工具，有望開創治療遺傳疾病及細胞工程的新途徑。
這項研究還促進了我們對 R2 逆轉錄元素生物學的基本理解，提供了這些元素如何在宿主基因組中自我繁殖的新見解。這突顯了基礎研究對推動生物技術創新的重要價值。
參考來源
这种垃圾DNA带来全新的CRISPR-Cas9基因编辑技术
PRINT涉及使用类似于将CRISPR-Cas9送入细胞进行基因组编辑的传递方法，将新的DNA插入细胞。在PRINT中，一段递送的RNA编码一种名为R2蛋白的常见逆转录酶蛋白， ...
來源： 生物通来自麻雀的逆转录转座子可将DNA插入人类基因组安全港
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